培养神经干细胞实验
- 作者:admin 来源:网络 日期:2009-4-9 21:17:42
3讨论
近年来，神经干细胞的研究发展迅速，但仍存在许多问题，如细胞移植时常常不能区别供体细胞与宿主细胞，不能较精确地观察植入细胞的存活及生长分化情况，也就难以对脑内移植的功效作出一个客观评价。随着基因工程技术的发展，人们可根据不同的科研及治疗目的，对神经干细胞进行不同的遗传学修饰，以期制成基因工程细胞，这些细胞极具科研和应用价值，受到广泛关注。病毒载体和非病毒载体是目前基因修饰中常用的两大类载体。非病毒载体有脂质体、质粒、分子偶联载体等，基因转移效率低。病毒载体应用最广泛，约占85%，其中腺相关病毒、逆（反）转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒是基因治疗中最常用的4种病毒载体，病毒载体安全性问题至关重要［8］。各种病毒载体都有自己的优点和不足，但是逆（反）转录病毒是随机整合入宿主DNA、可能会引起“插入诱变”、也有可能产生具有复制能力的病毒［9］；腺病毒不能整合到宿主染色体DNA上，表达时间短暂，所以不能持续表达所需产物，且可能刺激免疫反应［10］；单纯疱疹病毒对人类具有明显的致病性，能够从潜伏状态激活［11］。而AAV-2是一种单链的微小DNA病毒，需要辅助病毒才能有效地复制，具有与人类疾病无相关、宿主范围广，并能整合入宿主细胞DNA，去除其复制蛋白Rep和包装蛋白Cap基因,仅具有感染宿主的功能,安全性较高,成为较理想的基因修饰载体,倍受瞩目。其具有下列优点:目前尚未发现该病毒在人体中致病,所以比较安全；感染宿主细胞广泛,包括非分裂细胞和分裂细胞,特别是神经元和神经胶质感染性较强；能特异整合于人的第19号染色体长臂末端，减小了插入突变激活原癌基因的可能性，rAAV虽然失去了整合特异性，但反向末端重复序列中没有转录调控组件，因而减少了插入突变的可能性；外源基因表达稳定，可长达2年［2，12］。NSCs具有自我复制、增殖分化的能力，是基因修饰、基因治疗的靶细胞。
AAV-2能否有效地转染神经干细胞，且转染rAAV-2对神经干细胞存活、增殖、分化能力等有无影响，值得探讨。因为如果转染rAAV-2对神经干细胞存活、增殖、分化能力等天然性能产生影响，都会对细胞、机体造成严重后果，那么将会极大地限制其在基因修饰、基因治疗方面的应用。许多学者采用AAV转染神经干细胞，得到的结果各不相同。Hughes等［13］研究认为rAAV-2对神经干细胞球略有效率低下的转染能力，其仅观察5天转入基因的表达情况，而腺相关病毒转染细胞后基因表达的高峰期为1个月左右，转入基因5天时可能没有表达或者表达量很少。本实验分离培养了大鼠胚胎源性神经干细胞，用rAAV-2/EGFP转染NSCs，对其进行基因修饰，我们的结果提示：转染rAAV-2对神经干细胞存活、增殖、分化能力等未产生影响，rAAV-2对神经干细胞没有毒性作用，不影响神经干细胞的生物学特性，是神经干细胞间接体外法基因治疗的理想载体；MOI=1×104、1×105、1×106转染10天后，EGFP开始表达，荧光显微镜下可见弥漫于整个NSCs克隆球中的绿色荧光，起始表达强度不一，随MOI值的增大而增强，而且EGFP的表达强度随着时间的延长而逐渐增强，至转染后第21天达到高峰并维持,此后荧光指数不再增大；此时行流式细胞仪检测：MOI为1×104、1×105、1×106时转染率分别为25.68%、50.60%、54.72%,荧光指数（FI）分别为4.08、12.72、14.06。仅以转染率不能够全面衡量一个基因载体的转移效率，无法反映多拷贝基因转移，也不能反映目的基因的表达效率。荧光指数能更为全面地反映基因转移和表达效率；以GFP基因为报告基因，用流式细胞仪分析基因转移效率（转染率和荧光指数）优于传统人工计数法，并且还可用流式细胞仪进一步筛选表达EGFP阳性的细胞。AAV是通过靶细胞膜上的表面肝素聚糖蛋白（surfaceheparinproteinofglycans,SHPG）为受体介导转染的［14］，而受体的数目和功能是有限的，当AAV与受体结合达平衡时，发挥最大生物效应，再增大MOI也不会提高转染效率。因此我们可以解释rAAV-2/EGFP转染NSCs的效率随MOI值的增大而增强，但MOI为1×105、1×106转染效率相差不大，可能是AAV与受体结合达到了平衡，转染达到了稳定，结合实验经济因素，因而MOI=1×105为最佳MOI。另外，还有可能是由于神经干细胞AAV受体表达强弱、培养方法、转染时间、检测方法的不同等因素，引起不同学者实验研究结果上的差异。http://www.dxlww.net代写论文网
GFP相对分子质量小，这也是它作为报告基因的一大优点；GFP与目的基因融合后对目的基因的结构功能没有影响，大量表达对细胞也无毒性作用。在我们的研究基础上，将rAAV-2/EGFP与一些促进NSCs存活和定向分化的营养因子，如GDNF、VEGF等目的基因构建成融合基因，以GFP基因为报告基因，rAAV-2为载体，一起转染移植的NSCs，不需用其他检测方法，只需荧光显微镜下观察GFP的表达情况，便可针对另一基因作相关研究，将对中枢系统的研究手段有更好的应用价值。
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