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氟伐他汀对小鼠Lewis肺癌细胞增殖和凋亡的影响

作者:admin 来源:网络日期:2009-3-4 5:54:57

【摘要】目的观察氟伐他汀对小鼠Lewis肺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法用不同浓度氟伐他汀作用于培养的小鼠Lewis肺癌细胞，用活细胞计数检测细胞增殖，以CCK8试剂检测Lewis肺癌细胞生长抑制率，AnnexinVFITC/PI染色结合流式细胞仪定量检测氟伐他汀对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡影响。结果用不同浓度氟伐他汀（1、5、10和20μmol/L）处理小鼠Lewis肺癌细胞12、24、48和72h后，肺癌细胞增殖明显受抑制，细胞生长抑制率明显升高，这些作用呈明显剂量和时间依赖性，其中以10、20mol/L氟伐他汀、处理48和72h的作用最明显。AnnexinVFITC/PI染色后流式细胞仪检测表明，与对照组相比，20μmol/L氟伐他汀处理肺癌细胞48h后凋亡细胞明显增多（4.37%vs12.83%，P＜0.01），当氟伐他汀与甲羟戊酸共同作用细胞后，氟伐他汀引起的细胞凋亡被明显逆转（4.37%vs5.89%，P＞0.05），提示氟伐他汀对Lewis肺癌细胞的诱导凋亡作用是通过甲羟戊酸途径介导的。结论氟伐他汀能抑制小鼠Lewis肺癌细胞增殖并诱导其凋亡。

【关键词】氟伐他汀；Lewis肺癌细胞；细胞增殖；细胞凋亡

他汀类药物是一种有效的降血脂药，但近年来国内外很多研究表明，他汀类药物不仅能降低血脂，而且具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡及抑制血管生成等作用〔1〕，这些降脂以外的药理学特点引起了人们极大关注。近年的研究报道，洛伐他汀等他汀类能不同程度抑制黑色素瘤、急性髓性白血病、乳腺癌等多种肿瘤细胞的增殖〔2～4〕，但有关氟伐他汀对小鼠Lewis肺癌细胞作用的研究尚未见报道。本研究旨在观察氟伐他汀抑制小鼠Lewis肺癌细胞增殖和诱导凋亡的作用。

1材料与方法

1.1材料小鼠Lewis肺癌细胞株由吉林省肿瘤研究所提供；RPMI1640培养基和小牛血清购于Gibco公司；氟伐他汀（fluvastatin）北京诺华制药有限公司惠赠；甲羟戊酸（mevalonate，Mev）购自Sigma公司；AnnexinVFITC/PI试剂盒购自上海晶美生物公司；CCK8试剂为日本同仁化学研究所产品。CO2培养箱FormaScientific（美国），酶标测定仪（南京），FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）。http://www.dxlww.net代写论文网

1.2细胞培养小鼠Lewis肺癌细胞接种于含有10%小牛血清RPMI1640培养基的培养瓶中，置于37℃、含5%CO2孵箱中培养，2～3d换一次培养液，3～4d传代一次，传代前用0.25%胰酶消化。实验时取对数生长期细胞。

1.3Lewis肺癌细胞增殖能力的检测

1.3.1氟伐他汀对小鼠Lewis肺癌细胞增殖能力的影响取对数生长期Lewis肺癌细胞接种于24孔板，每孔接种浓度为（2×104）/ml细胞1ml。在相同实验条件下，加药组分别加入不同浓度的氟伐他汀（终浓度分别为1、5、10和20μmol/L），对照组加入溶解氟伐他汀的溶剂。每个条件设3个平行孔。于加药后0、1、2、3和4d，每孔加入0.4%台盼蓝染色液10μl，作用5min后用血细胞计数板计数活细胞数目。实验重复3次，取平均值。以药物作用时间为横坐标，以细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.3.2氟伐他汀对Lewis细胞生长抑制率的测定取对数生长期小鼠Lewis肺癌细胞，以浓度为1×104/ml加入96孔培养板，100μl/孔，在37℃、5%CO2孵养箱中培养，细胞贴壁后加药。加药组每孔加入终浓度分别为1、5、10和20μmol/L氟伐他汀。每个条件设3个平行孔。继续培养2、12、24、48和72h后，每孔加入CCK8试剂10μl。轻轻振荡使CCK8试剂与培养液混匀，在37℃、5%CO2孵箱中温育5h。以空白对照孔（不含细胞的培养基中加入10μlCCK8试剂）调零，用酶标仪在450nm波长处测定吸光度A值。并计算细胞生长抑制率：

细胞生长抑制率（%）＝对照组平均A值加药组平均A值对照组平均A值×100%。

1.4AnnexinVFITC标记法检测Lewis肺癌细胞凋亡按AnnexinVFITC试剂盒说明书操作：收集20μmol/L氟伐他汀处理48h的Lewis肺癌细胞，部分加药组在加入氟伐他汀的同时加入甲羟戊酸（终浓度为100μmol/L），经冷PBS洗2次，重悬于1×结合缓冲液250μl，浓度为1×106个/ml。取100μl细胞悬液至5ml试管中，加入5μlAnnexinV/FITC和5μl碘化丙锭，混匀，室温避光放置15min，在反应管中加入400μl1×结合缓冲液，用FACSCalibur型流式细胞仪检测细胞膜外表面磷脂酰丝氨酸结合蛋白的表达。

1.5统计学处理数据以x±s表示，采用SPSS13.0统计软件进行组间方差分析。

2结果

2.1Lewis肺癌细胞增殖能力的改变不同浓度（1、5、10和20μmol/L）氟伐他汀作用于小鼠Lewis肺癌细胞1～4d后，对Lewis肺癌细胞的增殖有不同程度抑制作用，且随着氟伐他汀剂量的增大和作用时间的延长，这种抑制作用更趋明显，呈剂量和时间依赖关系（图1）。

2.2不同浓度氟伐他汀对Lewis肺癌细胞生长的抑制作用用CCK8试剂检测氟伐他汀对小鼠Lewis肺癌细胞生长的抑制作用，实验结果显示，氟伐他汀对小鼠Lewis肺癌细胞生长有抑制作用。在同一处理时间点，随着氟伐他汀剂量的增加，细胞生长抑制率逐渐升高，呈剂量依赖关系，其中氟伐他汀10和20μmol/L抑制细胞生长的作用最明显；在相同氟伐他汀剂量下，随着药物作用时间的延长，细胞生长抑制率逐渐升高，呈时间依赖关系，处理24h后，细胞生长抑制率明显高于处理2h组，处理48和72h后，抑制细胞生长的作用进一步增加（P＜0.01，图2）。

2.3AnnexinVFITC/PI染色法检测细胞凋亡如图3所示。图3氟伐他汀对Lewis肺癌细胞凋亡的诱导作用细胞经AnnexinVFITC/PI双染色后用流式细胞仪检测，与对照组相比，20μmol/L氟伐他汀处理后的Lewis肺癌细胞凋亡数明显增多（4.37%vs12.83%，P＜0.01），说明氟伐他汀可诱导Lewis肺癌细胞的凋亡。但当氟伐他汀与甲羟戊酸共同处理细胞后，氟伐他汀引起的细胞凋亡可被明显逆转，凋亡细胞又明显减少（4.37%vs5.89%，P＞0.05），提示氟伐他汀对Lewis肺癌细胞的诱导凋亡作用是通过甲羟戊酸途径介导的。