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益智健脑颗粒对SAMP8小鼠海马蛋白质表达的影响
- 作者:admin 来源:网络 日期:2009-3-4 23:58:35
- 【摘要】目的运用蛋白质组学技术观察益智健脑颗粒对SAMP8小鼠海马蛋白质表达的影响，从而探讨益智健脑颗粒治疗阿尔茨海默病(AD)的部分作用机制。方法将6月龄SAMP820只随机分为治疗组(n=10)和对照组(n=10)，治疗组以益智健脑颗粒浓缩液灌胃，对照组以等剂量双蒸水灌胃。8w后，应用双向凝胶电泳(2DE)技术分别分离治疗组和对照组SAMP8海马区组织总蛋白，经胶体考马斯亮蓝染色，利用ImageScanner图像扫描仪及ImageMaster双向凝胶电泳软件对图像进行扫描分析，将有意义的差异蛋白质点经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOFMS)分析得到肽质量指纹图谱(PMF)，经MSDB和NCBI数据库查询，鉴定差异蛋白质点。结果鉴定出治疗组13个差异表达大于2倍的蛋白质，其中有8个上调，5个下调。结论益智健脑颗粒可调节SAMP8小鼠海马组织的多种蛋白质表达,提示该药具有多靶点治疗的作用。
【关键词】益智健脑颗粒；SAMP8小鼠；海马；双向凝胶电泳；质谱分析
益智健脑颗粒是董克礼教授多年临床实践治疗阿尔茨海默病(AD)的中药处方，临床上用于治疗AD之肾虚血瘀型,取得满意疗效〔1〕，动物实验研究能改善SAMP8小鼠的学习记忆能力〔2〕。本研究则在临床观察及前期动物实验的基础上，应用蛋白质组学技术鉴定益智健脑颗粒干预前后P8品系快速老化小鼠(SAMP8)海马组织的差异表达蛋白质，试图从蛋白质组水平探讨中药益智健脑颗粒治疗AD的作用机制，为临床用药提供理论依据。http://www.dxlww.net代写论文网
1材料与方法
1.1动物及分组选用6月龄20只雄性SAMP8小鼠，随机分为治疗组和对照组,每组各10只，由天津中医学院附属第一医院动物部提供。
1.2药物、试剂与仪器益智健脑颗粒由淫羊藿、锁阳、川断、田七等组成，其水提浓缩液，相当于1ml含3g生药，由湖南德康制药有限公司加工制成。双向凝胶电泳试剂：2DQuantKit蛋白定量试剂盒，尿素，硫脲，NP40，TritonX100，二硫苏糖醇，碘乙酰胺，固相pH梯度干胶条（pH3～10，24cm），IPG缓冲液（pH3～10），两性电解质（pH3～10），覆盖液，双向凝胶电泳标准蛋白质，考马斯亮蓝G250,溴酚蓝均为瑞典AmershamBiosciences公司产品；琼脂糖，过硫酸氨,丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，甘氨酸，三羟甲基氨基甲烷，CHAPS和十二烷基硫酸钠，碳酸氢铵，三氟乙酸、乙腈和基质α氰基4羟基肉桂酸均为美国SigmaAldrich公司产品。胰蛋白酶，美国Promega公司产品。PDQuest双向凝胶图谱分析软件是美国BioRad公司产品，MascotMS/MS数据库查询软件是英国Matrixscience公司产品，IPGphor等电聚焦仪，Imagescanner扫描仪均为瑞典AmershamBiosciences公司产品，DataExplorer质谱分析软件，VoyagerDESTR4307MALDITOFMS质谱仪是美国AppliedBiosystem公司产品。
1.3方法
1.3.1动物喂养及标本收集治疗组和对照组小鼠喂养于层流室，温度18～22℃，湿度55%～58%，饮水及饲料高温蒸汽灭菌。小鼠灌胃剂量每天30g/kg计算。治疗组给予中药益智健脑颗粒浓缩液灌胃，1次/d。对照组给予相同体积的双蒸水灌胃，1次/d，持续8w。8w后，迅速断头处死治疗组和对照组小鼠，置于冰上，剥出脑组织，用冷生理盐水冲洗干净，除去血渍，取出所需的海马，置于EP管中，迅速置于液氮中保存。
1.3.2海马组织总蛋白的提取及浓度测定将海马组织从液氮中取出，立即放入预先称重的EP管中进行称重。然后根据50mg样品组织加入约400μl组织裂解液的比例加入组织裂解液（7mol/L尿素、2mol/L硫脲，2%NP40，1%TritonX100，0.5mmol/LEDTA，40mmol/LTris，4%CHAPS，100mmol/LDTT，5mmol/LPMSF）混合后，用研磨工具使海马组织充分研磨裂解，室温下静置孵育1h，间或涡旋混匀，然后1200r/min，4℃离心1h，吸取上清即为组织的总蛋白质。取少许（5μl）上清液（组织总蛋白质）测定蛋白质浓度。采用AmershamBiosciences公司专门针对蛋白质组学研究的蛋白质抽提设计的2DQuantKit定量试剂盒测定蛋白质浓度。
1.3.3双向凝胶电泳每块胶的上样量1500μg。将胶条槽放置于平台上，将样品加入胶条槽中，取出IPG干胶条（pH3～10）置入含蛋白质样品的胶条槽中，再将胶条槽平行放置于IPGphor等电聚焦仪上进行第一向电泳。等电聚焦电泳结束后，将胶条先后放在平衡缓冲A液(平衡缓冲贮液10ml＋DTT100mg)和平衡缓冲B液(平衡缓冲贮液10ml＋碘乙酰胺250mg)中各平衡15min。然后将胶条转移至12.5%的PAGE分离胶上端，进行第二向电泳。
1.3.4图像染色与扫描将凝胶从玻璃板上剥离下来，双蒸水清洗干净后用考马斯亮蓝G250的蓝银染色方法进行蓝银显色，通过扫描仪及扫描软件进行扫描获取图像，使用PDQuest图像分析软件进行凝胶图像分析。
1.3.5质谱分析将蛋白质点从凝胶上切取下来，脱色、酶解后对样品萃取、点样。用MALDITOFMS质谱仪中进行分析，获得肽质量指纹图谱（PMF），再利用NCBI数据库进行检索。
2结果
得到背景清晰、分辨率高、重复性好的2DE图谱各3张。每张2DE图谱约有900个蛋白质点，大多数蛋白质点在位置和丰度上是一致的，主要分布在pH4～8的范围内。选择差异在两倍以上的16个蛋白质斑点作为差异表达的蛋白质点进行质谱分析，最后得到鉴定的差异表达蛋白质点为13个(各个蛋白具体在凝胶上的分布见图1)。这些蛋白质的功能分别涉及到细胞骨架蛋白、代谢相关酶类、信号传导和激素等多个方面。在治疗组中表达上调的有8个，分别为1、2、4、5、9、10、11、13号蛋白，表达下调的有5个，分别为3、6、7、8、12号蛋白。每个蛋白的具体情况见表1。表1差异表达蛋白质信息
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