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PPARγ胃癌表达曲格列酮对胃癌SGC7901生长影响
- 作者:admin 来源:网络 日期:2009-4-29 19:54:10
- 【摘要】 目的 探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）在胃癌及癌前病变中的表达，研究PPARγ激动剂曲格列酮（troglitazone,TGZ）对人胃癌细胞SGC7901生长抑制作用及其作用机制。方法 免疫组织化学方法检测PPARγ在胃癌及癌前病变中的表达；体外培养SGC7901细胞给予TGZ干预，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法、流式细胞术、苏木精-伊红染色、免疫细胞化学方法、Western blot检测TGZ作用后SGC7901细胞生长情况、凋亡率及细胞周期的改变、细胞形态学变化、PPARγ表达情况。结果 ①免疫组化染色结果显示在轻度不典型增生、重度不典型增生及胃癌标本中PPARγ阳性表达率为15.15％（5/33）、66.67％（14/21）、71.43％（60/84），轻度不典型增生与重度不典型增生及胃癌组间有统计学差异（P＜0.05）。②体外实验结果显示SGC7901细胞与不同浓度的TGZ共同培养，细胞的生长受到不同程度的抑制，TGZ 50 μmol/L组与对照组相比P＜0.05，同时其作用具有浓度及剂量依赖性，苏木精-伊红染色结果显示实验组肿瘤细胞的生长较阴性对照组逐渐稀疏，出现细胞体积变小、形态不规则、细胞皱缩、核固缩、胞浆空泡等形态学表现。免疫组织化学染色显示PPARγ在SGC7901细胞中有较高表达，50 μmol/L与阴性对照组及低浓度25μmol/L组相比P＜0.05，流式细胞仪检测结果显示TGZ 25 μmol/L组起作用72 h后，细胞凋亡率明显升高，处于G0/G1与S期的细胞比例与阴性对照组相比，具有统计学意义（P＜0.05）。Western blot结果显示 TGZ作用72 h后与阴性对照组相比，高浓度50 μmol/L组PPARγ表达增加（P＜0.01）。结论 应用TGZ可以将SGC7901细胞阻滞于G0/G1期，进而抑制其增殖。
【关键词】 过氧化物酶体增殖物活化受体γ; SGC7901胃癌细胞; 曲格列酮
Study on the expression of PPARγ and effects of TGZ on the growth of
SGC7901 gastric carcinoma cell line
CUI Tao1, LIU Ying1, ZHU Zu′an2, LIU Xia3
(1. Department of Pathology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221004, China; 2. Department of
Gastroenterology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002;
3. Department of Pathology, Xuzhou Central Hospital, Xuzhou, Jiangsu 221009)
Abstract: Objective To explore the expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) in gastric carcinoma and precancerous lesions and to investigate the inhibitory effects and mechanisms of TGZ, a PPARγ agonist on human gastric carcinoma cell line SGC7901. Methods 1. The expression of PPARγ protein in gastric precancerous and cancerous lesions was determined using immunohistochemical assays (PowerVisionTM two-step method). 2. SGC7901 cells cultured in vitro were treated with TGZ for intervention. MTT assay, flow cytometry, hematoxylin-eosine (H-E) staining, immunohistochemical assays and Western blotting were used to detect the morphological changes, the effects on the growth, apoptosis and the cycle progression and the expression of PPARγ of the human tumor SGC7901 cells, respectively. Results 1. The expressions of PPARγ were 15.15% (5/33), 66.67% (14/21) and 71.43% (60/84) in low grade atypical hyperplasia, high grade atypical hyperplasia and gastric carcinoma specimens， The differences were statistically significant (P<0.05). 2. The in vitro experiment revealed the inhibited growth of SGC7901 cells cultured with TGZ at the concentration of 50μmol/L, in a concentration- and dose-dependent manner, compared with the control group (P<0.05). H-E staining showed that the SGC7901 cells were sparser, with such morphological manifestations as diminished cell sizes, morphological irregularity, cell shrinkage, karyopycnosis and cytoplasmic vacuoles, etc. Immunohistochemical staining revealed an upregulated expression level of PPARγ in the SGC7901 cells, compared with the negative control group and the low concentration (25 μmol/L) group (P<0.05). Flow cytometry detection showed that the apoptotic rate of the tumor cells markedly increased 72 hours after 25μmol/L TGZ treatment, with the tumor cells arrested in G0/G1 phase and reduced in S phase, compared with the negative control group (P<0.05). Western blot detection showed 72 hours after TGZ acted on 50μmol/L group, the expression of PPARγ increased compared with negative control group (P<0.01). Conclusion PPARγ agonists can reduce cell proliferation and cell cycle progression in SGC7901 cells by G0/G1 phase arrest.
Key words:PPARγ; gastric SGC7901 carcinoma cell; TGZ http://www.dxlww.net代写论文网
过氧化物酶体增殖物活化受体（peroxisome proliferators-activated receptor, PPAR）属于核受体超家族成员，是一类由配体激活的核转录因子；人类PPAR有3种亚型，分别为PPARα、PPARβ/δ、PPARγ［1］。研究发现PPARγ在脂肪肉瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌等肿瘤组织和细胞系中有较高水平的表达，但是研究同时显示PPARγ激动剂能诱导胃癌细胞、结肠癌细胞株分化，抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡［2-4］。目前，对于PPARγ在胃癌发生发展中的具体作用尚不明确。本研究在通过免疫组织化学方法检测PPARγ在胃癌中的表达的同时，体外培养人胃癌SGC7901细胞给予PPARγ激动剂干预后检测胃癌细胞增殖的改变，以探讨PPARγ在胃癌发生发展中的作用。
1 材料和方法
1.1 PPARγ在胃癌及癌前病变中的表达
1.1.1 标本来源 所有标本取自徐州医学院附属医院2001～2004年胃镜活检及手术切除标本。84例胃癌中男性 61例,女性 23例,年龄31～77岁,平均 57.5岁,有淋巴结转移 56例。不典型增生标本中,轻度不典型增生 33例,重度不典型增生 21例。所有胃癌患者术前均未经过化疗和放疗。
1.1.2 试验方法 采用免疫组化PowerVision两步法进行染色 (按试剂盒说明书进行,抗原修复均采用高压热修复 )。用 PBS取代一抗作为空白对照 ,已知阳性组织片作为阳性对照。PPARγ购自北京中杉试剂公司（美国Santa Cruz公司产品，sc-6285）。PPARγ主要定位于细胞核，染色后光镜观察免疫组化染色切片的显色反应，高倍镜下计数10个高倍视野，阳性细胞计数>10% , 判定为阳性。
1.2 体外实验 体外培养人胃癌SGC7901细胞（购自上海细胞生物学研究所），给予PPARγ激动剂曲格列酮（troglitazone，TGZ，美国Cayman公司）干预后检测胃癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的改变。
1.2.1 实验分组 以DMSO液体配成浓度100 mmol/L，-20℃保存备用。TGZ作用浓度分为6组：0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L共6个剂量组。四唑蓝比色试验按照上述分组进行，根据MTT结果挑选出第1、4、5组进行苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色、Western blot 检测蛋白表达及流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期。
1.2.2 四唑蓝比色试验（MTT法） 取SGC7901细胞1×108/L接种于96孔培养板,每孔200 μl，置37℃、5%CO2及饱和湿度条件下待24 h细胞贴壁生长后，弃上清，按照上述实验分组设计分别加入含有TGZ的培养液，每组设6个复孔，重复2板，分别培养至48 h、72 h，弃上清，每孔加入5 g/L MTT液20 μl，4 h后每孔加入150 μl DMSO振荡混匀，酶标仪测定490 nm处的吸光度，计算抑制率。抑制率=（1－给药组D值/空白组D值）×100%。
1.2.3 苏木精-伊红染色 用1640培养液稀释肿瘤单细胞悬液浓度至2×105/ml，以每孔1 ml单细胞悬液接种于6孔板中，培养板每孔内放置3枚直径10 mm的圆形盖玻片。按照实验分组设计，每组每孔分别加入含有TGZ的培养液各1 ml。当SGC7901细胞与TGZ共同培养72 h后，取出6孔板内的玻片，4%多聚甲醛固定5～10 min，取出晾干，干燥彻底后即可进行苏木精-伊红染色，观察形态学改变。
1.2.4 免疫组织化学染色及Western blot 检测TGZ作用72h后SGC7901细胞PPARγ表达
1.2.4.1 免疫组织化学染色步骤 用1640培养液稀释肿瘤单细胞悬液浓度至2×108/L，以每孔1 ml单细胞悬液接种于6孔板中，培养板每孔内放置3枚直径10 mm的圆形盖玻片。按照上述实验分组设计，每组每孔分别加入含有TGZ的培养液各1 ml。当SGC7901细胞与TGZ共同培养72 h后，取出6孔板内的玻片，4%多聚甲醛固定5～10 min，取出晾干，干燥彻底后即可进行免疫细胞化学染色(SP法)。PPARγ一抗稀释浓度1∶300，PPARγ表达的判定以细胞核中有明显棕黄色或棕褐色
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