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银杏叶提取物对点燃模型幼鼠学习记忆及海马乙酰胆碱酯酶、胆碱乙酰转移酶活性的影响
- 作者:admin 来源:互联网 日期:2009-5-1 19:28:38
- 【摘要】 目的 研究银杏叶提取物(EGb)对点燃模型幼鼠学习记忆等认知功能，对大鼠海马乙酰胆碱酯酶（AChE）、胆碱乙酰转移酶（ChAT）活性的影响。方法 21、35日龄SD大鼠各40只，经初筛后随机分为生理盐水对照组、点燃对照组及EGb大、中、小剂量治疗组，采用戊四氮（PTZ）诱导幼鼠点燃模型，以Y型电迷宫及生化检测方法，观察用药前后大鼠学习记忆功能和海马AChE、ChAT活性的变化。结果 EGb呈剂量依赖性显著改善实验大鼠的学习记忆能力,并显著抑制海马AChE活性、增强ChAT的活性。结论 EGb可以通过抑制功能脑区AChE活性、增加ChAT的活性,增强中枢胆碱能神经系统的功能，改善发育期癫疒间大鼠学习记忆功能。
【关键词】 银杏叶提取物；学习记忆；乙酰胆碱酯酶；胆碱乙酰转移酶；点燃模型；大鼠
Effect of extracts of Ginkgo biloba leaf on the learning-memory ability and the activity
of AChE and ChAT in the hippocampus in rats with kindling-induced epilepsy
DUAN Fangrong, YUAN Baoqiang*
(Department of Pediatrics, The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)
Abstract:Objective To investigate the effects of extracts of Ginkgo biloba leaf (EGb) on the cognitive functions such as learning and memory abilities and possible mechanisms in young rats with kindling-induced epilepsy, and on the activity of acetylcholinesterase (AChE) and choline acetyltransterase (ChAT) in rat.Methods 40 postnatal day 21 (P21) and 40 postnatal day 35 (P35) Sprague-Dawley (SD) rats were randomly assigned respectively into 5 groups: normal saline (NS) control, kindling epilepsy model, high, middle and low dosage of EGb-treated kindling epilepsy after preliminary screening by Y-maze test. The kindling model was established by an intraperitoneal injection of pentetrazole (PTZ). The variations of learning-memory ability and the activity of AChE and ChAT in the hippocampus were observed by Y-maze test and biochemistry determination.Results EGb could obviously improve the achievement of Y-maze test of the kindling model in a dose-dependent manner, with the activity of AChE and ChAT in the hippocampus inhibited and increased, respectively.Conclusion EGb can improve learning-memory ability in epileptic rats of developmental phase by increasing the ChAT activity and reducing the AChE activity, which may contribute to its action in improving the ability of cholinergic nervous system.
Key words: extracts of Ginkgo biloba leaf; learning-memory; AChE; ChAT; kindling model; rats
银杏叶提取物(extracts of Ginkgo biloba leaf, EGb)是从银杏叶中利用醇溶液提取出的混合成分，主要含有银杏总黄酮苷、银杏内酯和有机酸等，具有多价性药理作用［1］。其作为一种中枢神经赋活剂，目前国内外已将EGb 广泛应用于治疗脑动脉硬化、脑梗死后遗症和老年神经精神症状如注意力不集中、记忆力减退、意识模糊等，在临床上明显地改善了脑功能不全患者的学习记忆能力，因而被认为是一种“认知增强剂”［2-4］。目前认知问题亦是癫疒间儿童在临床诊断和治疗中的常见症状，但尚缺乏较好的处理措施。而关于EGb对癫疒间患者尤其是癫疒间儿童学习记忆等认知功能障碍影响的实验研究或临床研究少见报道。本研究旨在探讨EGb对癫疒间模型幼鼠认知功能的影响及可能机制，为临床应用EGb治疗癫疒间儿童认知功能障碍提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 21、35日龄SD幼鼠，体重55～95 g，雌雄不分，由徐州医学院实验动物中心提供。
1.1.2 药物及试剂 EGb（银杏总黄酮苷＞24%，银杏内酯＞6%，峰比0.8～1.0,银杏酸＜1×10-6%），由徐州富伟生化制品有限公司惠赠；戊四氮(PTZ)购于Sigma公司；AChE、ChAT试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.1.3 仪器 Y型电迷宫，张家港生物医学仪器厂生产；GL20C超速冷冻离心机，武汉科学仪器厂生产；752紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司生产;水浴箱，上海医学仪器厂。
1.2 方法
1.2.1 动物模型的建立 参考文献［5］方法。用PTZ 亚惊厥剂量（32 mg/kg）,腹腔注射,每天1次,连续注射28天。停药1周后,再用相同剂量的PTZ 测试。癫疒间发作行为按Racine标准分为6级,即：0级，未发作；Ⅰ级，头面部抽搐；Ⅱ级，肌阵挛、跳起,但无直立； Ⅲ级，肌阵挛,双前肢抬起伴有直立；Ⅳ级，强直-阵挛性惊厥；Ⅴ级，全身强直-阵挛性惊厥伴有翻滚、跌倒。凡显示连续5次2级以上惊厥的大鼠,被认为达到点燃标准，即点燃模型制备成功。
1.2.2 动物分组及药物处理 先用Y型电迷宫初步筛选21、35日龄大鼠各40只，然后进行点燃模型的制备，造模成功后随机分为5组(n=8)：生理盐水组(NS组)、点燃对照组(PTZ组)、EGb大剂量300 mg/kg治疗组(PTZ+EGb1组)、EGb中剂量200 mg/kg治疗组(PTZ+EGb2组)、EGb小剂量100 mg/kg治疗组(PTZ+EGb3组)。EGb以5%的乙醇为溶剂制备成10%的混悬液，采用灌胃给药,NS组和PTZ组给予相同体积的生理盐水,每日1次，连续给药7天。所有大鼠均在同一实验室和动物中心操作和饲养，以保持喂养、光照、噪声等条件相同。
1.2.3 学习记忆功能的训练与评定 参照王跃春［6］方法，电流强度0.7 mA，电压50 V，电击延时5 s。
筛选：将大鼠放入Y型迷宫箱中适应3 min后，给予适当电击，至其对3臂均探索进入为止，选择活跃、对点击反应较敏感、逃避反应迅速者供测试用。淘汰反应过于迟钝或特别敏感的大鼠。
训练及评定：采用随机休息不固定训练次数法，以大鼠在足底通电后15 s内一次性进入安全区的反应为正确,直至大鼠在连续10次电击中有9次或以上正确（9/10标准）为达到学会标准，以每只大鼠达学会标准所需电击次数表示大鼠的学习记忆成绩。所有训练在1个实验日内完成 。各组在造模后次日及治疗后7天进行认知功能的评定。
1.2.4 海马AChE、ChAT活性的测定 在完成认知功能评定步骤后断头处死大鼠, 冰台上迅速取脑并剥离海马,用滤纸吸去海马上的血液,精密称重,脑重∶生理盐水以1∶9比例加入4℃生理盐水制成脑匀浆,3000 r/min离心10 min,取上清液待测。 http://www.dxlww.net代写论文网
海马AChE、ChAT活性的测定严格按试剂盒说明进行，752型紫外分光光度计进行比色。脑组织蛋白测定采用考马斯亮兰试剂盒。
设定每毫克组织蛋白样本在37℃保温6 min,水解反应体系中1 μmol基质为1个AChE活力单位；在pH7.2条件下，25～30℃时每分钟转移1 nmol乙酰胆碱的能力定义为一个ChAT活力单位。
1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行数据处理，所有计量资料数据以±s表示；多组间的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，治疗前后的比较采用配对t检验（Paired-Samples T Test）,不同日龄组的比较采用独立样本t检验(Independent-Sample T Test)；P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 点燃模型的建立 PTZ腹腔注射1周左右大鼠陆续出现程度不等的疒间性发作,为Ⅰ～Ⅲ级,以后发作程度逐渐加剧,在连续注射28天后所有大鼠均达到点燃标准。大鼠的疒间性发作基本上在每次腹腔注射PTZ 后5～6 min 出现,一般在10 min左右达到高峰,高峰过后时而表现安静,时而有阵发性阵挛,一般30 min 后很少再有抽搐发作。PTZ点燃成功的大鼠, 有慢性、自发性、复发性的发作过程。
2.2 各组大鼠行为学测试 Y型电迷宫测试结果见表1。
2.2.1 治疗前 不管是21日龄还是35日龄的大鼠，PTZ各组与其同龄NS组相比，达到学会标准所需的电击次数明显增多(P<0.01)，而PTZ各组之间没有明显差异(P>0.05)；21日龄与35日龄的PTZ各组相互比较，前者达标次数亦明显增多(P<0.05);21日龄与35日龄的NS组相互比较差异无统计学意义。表1 各组大鼠Y型电迷宫试验达标所需电击次数与NS组比较：*P<0.01；与治疗后PTZ组比较：#P<0.01；与PTZ+EGb2组比较：※P<0.01；与同组治疗前比较：☆P<0.05；与21日龄组比较：△P<0.05。
2.2.2 治疗后 2个日龄EGb治疗组达到学会标准的次数均明显少于同龄PTZ组(P<0.01)；同龄EGb大、中、小剂量治
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